一步蛋白纯化获得高产、纯度和活性

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在伯明翰的阿拉巴马大学开发了一种新的方法来提高高产量、高纯度、高活性的复杂蛋白质的纯化方法,这种方法被开发了10 - 500倍。/p 泰国试管婴儿 泰国试管婴儿成功率 雅堂 美国试管婴儿官方 试管婴儿检查方法 夏令营入营 怎样去泰国做试管宝宝

UAB的生物化学和分子遗传学教授Dmitry Vassylyev说:“这项新方法为研究人员和制药行业提供了许多重要的优势。”“它可能是对许多重要生物系统进行高通量研究的最有效和最普遍的工具,可能有助于大规模生产治疗蛋白质。”
高产量、高纯度、高活性的净化,或HHH,是结构和工业应用的圣杯。Vassylyev说,UAB单步净化方案克服了目前市面上可用的净化系统的明显弱点。
在发表在《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)杂志上的一篇论文中,Vassylyev和UAB的同事测试了他们的CL7 / Im7亲和层析法,在5个传统的具有挑战性的生物分子上,包括原核生物和真核生物膜蛋白和多亚单位DNA / rna结合蛋白。
“一个明显的例证CL7 / Im7性能优越的方法,”他们写道在PNAS的报告,“是CNX蛋白质样品,我们在几个小时内纯化,从只有几克的大肠杆菌细胞,市值约为400000美元,根据目前的商业价格。”
该系统简单易行,UAB研究人员已经恢复并重复使用其亲和层析柱100多次,保持了几乎100%的结合能力。
该方法是基于细菌毒素与特异性免疫蛋白之间具有极强的结合亲和性。宿主细菌可以释放一种大肠杆菌毒素,如大肠杆菌E7 dnase,它能杀死其他细菌。在寄主细菌内部,CE7与免疫蛋白7或Im7结合;这种结合防止了自我造成的破坏。
CE7/ Im7的结合亲和力几乎和共价键一样强,比其他亲和层析类似物高4到7个数量级。Vassylyev和他的同事们做了一种不活跃的CE7,叫做CL7,它没有DNase活性,但对Im7仍然具有完全的结合亲和性。他们还制造了一种Im7的变体,可以有效地与agUNK珠子进行耦合。
在真核生物和原核生物中,利用遗传技术,CL7标记很容易插入到目标蛋白质的基因中。这些基因可能被转移到一个表达载体上,或者标记的目标蛋白可以从本地细胞表达而不被放大。
当一种粗蛋白裂解液通过一列充满了Im7 -琼脂糖珠的柱子时,靶蛋白上的CL7标记与Im7结合。一个工程蛋白酶位点被用来从被束缚的CL7标签释放目标蛋白。这允许一步HHH净化,97%到100%纯度,用于UAB研究人员测试的目标蛋白。
相比之下,这些具有挑战性的蛋白质的大多数发布的净化方案都是多步骤、多天的协议,产量较低。蛋白质结晶学家Vassylyev说,获取大量的纯蛋白是晶体学中的限速步骤,这促使他在四年前开始寻找一种更好的方法。
在PNAS报告中提纯的具有挑战性的蛋白质是细菌Thermus thermophilus RNA聚合酶和分枝杆菌的结核分枝杆菌,它们是多亚单位的蛋白质;YidC膜整合酶,一种芽孢杆菌膜蛋白;它是一种人类的跨膜伴侣蛋白;而两种核酸结合蛋白,即能折叠和压紧细胞DNA的伤寒沙门氏菌的多亚单位凝蛋白复合物,以及人类重构和间隔因子复合物,RSF,与介导的核体组装有关。
简单的净化系统也适用于下拉实验和动力学活动或结合试验,如表面等离子体共振。它也可以帮助低温电子显微镜。/p 泰国试管婴儿 泰国试管婴儿成功率 雅堂 美国试管婴儿官方 试管婴儿检查方法 夏令营入营 怎样去泰国做试管宝宝

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